刘静1 韩冬梅1 王志东1 薛梅1 朱玲1 阎洪敏1 郭子宽2 王恒湘1

【摘要】 目的 观察脐带间充质干细胞（UC-MSCs）鞘内注射治疗脊髓损伤（SCI）的临床效果及安全性。方法 对2008年1月至2010年10月收治的22例SCI患者，给予UC-MSCs鞘内注射治疗，细胞数1x106个/kg.次，1 次/周，4次为1个疗程，其中4例接受两疗程，1例接受3疗程，余均接受1 个疗程。采用美国脊髓损伤协会制定的脊髓损伤神经功能评分标准(ASIA标准)对患者治疗前后神经功能进行评定，采用国际神经修复学会脊髓损伤功能评价量表（IANR-SCIRFS）对患者治疗前后日常生活活动能力进行评定。结果 22例患者中13例有效，9例无效。不完全性SCI患者有效率达81.25%，完全性SCI的6例患者均无效。有5例有效的患者接受了2～3个疗程治疗，疗效均有进一步的提高。有效患者多表现为运动和/或感觉功能改善，大小便控制能力增强。22例患者治疗后1个月与治疗前两组间比较痛觉、触觉、运动、日常生活活动能力评分有明显升高(P < 0.01)。治疗后常见的不良反应有头痛（1例），腰痛（1例），均在1～3天内消失。随访3个月～3年，无治疗相关不良事件发生。结论 UC-MSCs鞘内注射治疗是安全的，可以改善大部分不完全性SCI患者的神经功能，提高这些患者的生活质量。

【关键词】 脐带间充质干细胞；脊髓损伤

Clinical analysis of umbilical cord mesenchymal stem cells treating spinal cord injury

LIU Jing1,HAN Dongmei1,WANG Zhidong1,XUE Mei1,ZHU Ling1,YAN Hongmin1,GUO Zikuan2,WANG Hengxiang1

1 100142 Department of Hematology, General Hospital of the Air Force,Beijing

2 100850 Department of Experimental Hematology,Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing

【Abstract】 OBJECTIVE To observe the clinical effect and safety of

基金项目：首都发展基金项目（2007-2033）；国家高新技术研究发展计划（863项目）（2007AA 022454）；国家重大新药创制基金（20092x09503-019）；军队临床高新技术重大项目（2010gxjs049）

作者单位：100036 北京，空军总医院血液科（刘静 韩冬梅 王志东 薛梅 朱玲 阎洪敏 王恒湘）；100850北京，北京放射与辐射医学研究所（郭子宽）

通信作者：王恒湘，Email：wanghengxiang123@yahoo.com.cn

umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) in treating spinal cord injury (SCI) by intrathecal injection. METHODS From January 2008 to October 2010,22 admitted patients with SCI were given UC-MSCs by intrathecal injection,at a dose of 1 x 106 cells/kg body weight once a week,4 times as a course.Besides 4 cases received 2 couses and 1 cases received 3 couses,others received 1 couse.American Spinal Injury Association (ASIA) scoring system and International Association of Neurorestoratology SCI Functional Rating Scale (IANR-SCIFRS) were used to evaluate SCI patient’s neural function and ability of daily living. RESULTS Among 22 cases,13 cases were effecttive,9 cases had no response. The effective rate of incomplete SCI cases was 81.25%,all of 6 cases with complete SCI had no response. There were five effective patients received 2～3 couses therapy,effects were further enhanced. In most effective patients,motor and/or sensory functions improved,bowel and bladder control improved. One month after therapy compared with before therapy, 22 patient’s algaesthesis,tactile sensation,motion,activity of daily living scale were obviously increased (P < 0.01). After therapy,common adverse effects were headache (1 case),low back pain (1 cases),all disappeared within 1～3 days.Follow up 3 months to 3 years,no treatment-related adverse events happened.CONCLUSION UC-MSCs therapy by intrathecal injection is safe,and can ameliorate most of incomplete SCI patient’s neurological function,as well as improve these patient’s quality of life.

【Key Words】 umbilical cord mesenchymal stem cells,spinal cord injury

SCI是一种较为常见的神经系统严重创伤, 常导致瘫痪及大小便失禁,手术、药物、康复理疗治疗效果欠佳。UC-MSCs来源于脐带，易于获取，体外能够大量扩增，低免疫原性，具有横向分化的潜能，在适当的条件下可向外胚层的神经细胞分化。临床上，采用人UC-MSCs治疗SCI国内尚无报道，我们采用UC-MSCs鞘内注射治疗22例SCI患者，取得一定疗效，现报告如下。

资料与方法

一、 研究对象

对象选择自我科2008年1月至2010年10月收治的22例SCI患者，男17例，女5例，年龄19～51岁，平均年龄33岁；损伤部位：颈髓4例，颈髓+胸髓2例，胸髓7例，胸髓+腰髓2例，腰髓7例；损伤时间2～204月，平均56个月。损伤原因：车祸8例，高空坠落7例，砸伤及跳水损伤各2例，摔伤、脊髓炎后遗症、脊髓栓系综合征各1例。对患者的治疗及风险如实告知，患者对治疗均签署知情同意书，治疗方案经医院医学伦理委员会批准。所有患者均具有干细胞治疗适应症：无发热、感染，无凝血功能及心、肺、肝、肾等重要脏器功能障碍。术前对患者进行总体评估：体格检查，ECG、脊髓损伤部位MRI检查，血、尿、便常规、肝肾功、凝血象、手术感染8项。

二、方法

1. UC-MSCs制备：按参考文献提供的方法[1]，稍加改良后进行UC-MSCs制备。简言之，经知情同意及感染源检定后收集脐带，去除外膜和动静脉，将脐带剪成0.5cm3大小的组织块，加入等体积0.2%I型胶原酶，37℃消化过夜。次日，加入两倍体积的0.05%的胰蛋白酶，37℃消化1小时。2000rpm离心10分钟收集细胞，计活细胞数。将细胞悬浮于人MSC无血清培养基（杭州百威）中，按106细胞/cm2底面积接种于塑料培养瓶中。1周后出现由数十个形态类似于成纤维细胞组成的集落。加入0.05%胰蛋白酶消化，并按6000细胞/cm2底面积进行传代培养。利用流式细胞术测定细胞表型，常规感染源检定后，收集细胞用于治疗。或收获细胞放于-80℃冰箱冻存备用,用前，在37℃环境下快速复苏,24～48小时培养，收获贴壁生长的细胞供临床应用。

2. UC-MSCs注射：入院第3或第4天开始给患者行腰穿，鞘内注射UC-MSCs，1次/周，4次为1个疗程。按诊疗常规进行腰穿，将UC-MSCs 10 mL(1x106/kg.次)+地塞米松5mg在10 min内缓慢注入蛛网膜下腔，拔针，敷以无菌辅料，嘱患者去枕平卧6 小时。

3．辅助治疗：系统康复锻炼。

4．评估标准[2]：（1）采用美国脊髓损伤协会制定的脊髓损伤神经功能评分标准(ASIA标准)对患者治疗前后神经功能进行评定：检查颈2到骶4～5神经支配的身体两侧各自28个皮节区痛觉和触觉，按消失、减退、正常分别给予O、l、2分，痛觉、触觉总分均为112分；检查颈5到骶1神经支配的身体两侧各自10个肌节中的关键肌，按肌力0～5级分别给予0～5分，总分为100分；（2）采用国际神经修复学会脊髓损伤功能评价量表（IANR-SCIRFS）对患者治疗前后日常生活活动能力进行评定，包括上、下肢、躯干、全身运动功能、括约肌功能、肌张力、泌汗、皮肤营养、疼痛，最高分48分为正常。分值越低表示神经功能缺损越严重，日常生活活动能力越差；（3）损伤完全性评定：完全性损伤：损伤平面以下包括骶4～5既无感觉也无运动功能；不完全性损伤：损伤平面以下包括骶4～5有感觉（或）运动功能。

5．不良反应及并发症观察：观察治疗中及治疗后有无发热、腰痛、头痛、头晕等不良反应。

6．随访 对患者治疗后3个月、半年以及之后每半年随访1次，观察病情变化。

7． 统计学分析：采用SPSS 11.5软件包进行统计处理，计量资料以 SD表示，行数据配对t 检验、成组资料t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

结果

一、临床疗效：

1．22例患者中13例有效，总有效率为59.1%，9例无效。有5例有效的患者接受了2个或3个疗程治疗，疗效均有进一步的提高。有效患者多表现为运动和/或感觉功能改善，大小便控制能力增强。

2. 22例患者ASIA评分及IANR-SCIRFS评分显示：治疗后1个月与治疗前两组间比较痛觉、触觉、运动、日常生活活动能力评分有明显升高(P < 0.01)，见表1。

3．16例不完全性SCI患者中13例有效，有效率达81.25%，3例无效，治疗结束后1个月与治疗前两组间比较，痛觉、触觉、运动及日常生活活动能力评分有明显提高(P < 0.01)，6例完全性SCI患者均治疗无效，见表2。

4.SCI部位存在软化灶的6例患者中5例治疗无效，无效的患者2例为不完全性SCI，3例为完全性SCI。

5.有效的13例患者损伤的时间2～204个月，平均59个月，无效的9例患者损伤时间4～136月，平均51个月，两组患者损伤时间无显著差异（P > 0.05）。

6.不良反应及并发症：UC-MSCs治疗中及治疗后，患者的生命体征均平稳。1例治疗后感头痛，1例治疗后感腰痛，未经特殊处理，1～3天后症状消失。无发热及其他不良反应。

7.随访 13例有效患者中9例治疗1月后疗效不再增加，3例治疗3月后疗效不再增加，1例治疗1年后疗效不再增加；9例无效患者病情无变化；所有患者无UC-MSCs治疗相关的不良事件发生。

讨论

SCI是致残率最高的疾病之一，最常发生于青壮年，导致病人损伤平面以下感觉、运动功能丧失和/或大小便失禁,不仅给病人造成极大的痛苦,同时也给家庭和社会带来沉重的负担。脊髓损伤可分为外伤性和非外伤性两种，前者占90%以上。本组患者除2例疾病引起外，20例为外伤所致，其中车祸、高空坠落为主要外伤原因，占75%。目前SCI修复面临的主要问题是：原发和继发性神经元死亡，大量的轴突变性和弥漫性脱髓鞘；损伤后胶质瘢痕形成阻碍了轴突生长；局部炎症反应和神经营养因子、神经生长因子的缺乏，以及SCI后损伤区微环境中大量的抑制因子的产生(如硫酸软骨素蛋白多糖、髓磷脂相关糖蛋白等)，极大地阻碍了损伤神经的修复。手术、药物、物理康复等治疗都不能有效地解决这一世界级难题。间充质干细胞（MSCs）具有来源广泛、取材容易、具有强大的增殖能力、在体外长期培养过程中始终保持其多向分化潜能，在适宜的条件下能分化为神经元及神经胶质细胞，还可分泌多种神经营养因子（NTFs）如神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）[3,4]，且在异基因移植中不存在免疫排斥反应[5]，也不涉及医学伦理问题，为中枢神经系统损伤提供了新的治疗途径。

动物实验已证明MSCs具有促进神经修复的作用。将大鼠MSCs注入脊髓损伤大鼠蛛网膜下腔，损伤部位的MSCs明显高于未受损部位，一些MSCs可分化为神经元和神经胶质细胞，促进脊髓损伤的修复，且在体内无免疫排斥[6,7]。Yang等[4]将人UC-MSCs移植到完全性横惯性SCI大鼠的损伤部位，大鼠的运动功能得到显著改善，病变周围皮质脊髓束再生轴突和神经微丝的数目显著增加。目前MSCs治疗SCI所取得的研究成果多局限于动物模型，在临床上的应用仍处于起步阶段。Pal等[8]将体外扩增的自体骨髓MSCs（1x106个/kg体重）鞘内注射给30例SCI患者，随访1～3年无不良事件发生。Ichim等[9]将异基因体外扩增的脐带血CD34+细胞及UC-MSCs分别于损伤后5月、8月、14个月鞘内注射给1例腰髓损伤患者，该患者肌力、排便及性功能改善，神经疼痛减轻，无副作用发生。我们将体外扩增的UC-MSCs鞘内注射给22例SCI患者，总有效率为59.1%，有效患者增加疗程数疗效有一定提高；对不完全性SCI患者有效率达81.25%；但对完全性SCI患者无效；损伤部位如果存在软化灶的患者总体疗效欠佳，6例患者中仅1例有效。治疗过程安全，随访3月～3年无不良事件发生。

MSCs可来源于骨髓、脐带以及脐血。骨髓MSCs含量低，104～105个骨髓单个核细胞含有1个MSC，患者要经历采髓过程，还需要等待3周左右体外培养扩增；人脐血含有MSCs，但传代培养困难，不易大量获得；人脐带华尔通胶含有丰富的MSCs，在体外能够大量扩增，还可将其冻存，应用前复苏，短时间内即可收获足够量的细胞。Shetty等[10]比较骨髓、脐带、脐血获得的MSCs，这三种来源的MSCs具有同样的MSCs表面分子表达：CD73+、CD105+、SSEA4+、CD29+、CD44+、HLA ABC+，而脐带MSCs（UC-MSCs）与脐血MSCs（UCB-MSCs）不表达与移植排斥相关的HLA DR，在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制，并抑制T细胞增殖，异体移植该细胞可产生免疫耐受性[5]，表明其为一类免疫缺陷细胞，异基因移植不会发生免疫排斥反应。基于上述，我们选择人UC-MSCs治疗SCI。

鞘内注射的MSCs进入脊髓组织时要通过脑脊液-脑屏障， 其通过的机制可能包括：(1)脊髓损伤各种炎性因子和血管活性物质释放，使脑脊液-脑屏障的通透性增加；(2)脊髓损伤部位对MSCs具有一定的趋化作用。关于UC-MSCs治疗脊髓损伤的作用机制尚不完全清楚，可能有：(1)UC-MSCs向病变部位组织渗透融合，一些移植的MSCs在新的环境下表达神经细胞表型，替代损伤细胞，重建神经通路，达到恢复神经功能的目的；(2) UC-MSCs分泌的各种NTFs，如NGF、BDNF、GDNF等，支持神经细胞生存，诱导内源性神经细胞再生，促进神经纤维在损伤部位再生 [11,12];(3)通过细胞间的接触、可溶性细胞因子分泌，抑制T淋巴细胞活性，调节炎性反应[13]。

MSCs移植治疗SCI的适宜时间，目前研究尚未统一。从病理机制上讲，SCI后急性期由于血-脊髓屏障破坏，损伤区有严重的免疫炎性反应，多种炎性因子具有神经毒性及胶质细胞的诱发作用，使局部的微环境不适合MSCs的存活和分化。而SCI时间过长，损伤区胶质瘢痕的形成不利于轴突的生长。Okano等[14]提出SCI后干细胞移植的最佳时间应选择在损伤后l～2周，在此期间进行移植，既可解除急性期各种炎性因子对移植细胞的损害，又可避免慢性期胶质瘢痕对轴突再生的干扰。本组患者均在慢性期行MSCs治疗，有效患者与无效患者在损伤时间上无明显差异。

本研究表明，UC-MSCs蛛网膜下腔注射治疗SCI是安全的，可使大部分不完全性SCI患者神经功能在一定程度上得到恢复，但对完全性SCI患者无效，存在软化灶的患者多数疗效较差。UC-MSCs治疗SCI的作用机制有待进一步研究，移植时机的选择、取得显著疗效所需的MSCs的数量、疗程数，以及最佳的治疗途径，需要大宗病例长期的随机对照研究。

参考文献

[1] Avanzini MA, Bernardo ME, Cometa AM, et al. Generation of mesenchymal stromal cells in the presence of platelet lysate: a phenotypic and functional comparison of umbilical cord blood- and bone marrow-derived progenitors [J]. Haematologica, 2009, 94(12):1649-1660.

[2] 黄红云主编.中枢神经修复学，北京科学出版社，2009年4月第一版。第十三章 ：P221-225，P234-235。

[3] Lee PH,Park HJ. Bone marrow-derived mesenchymal stem cell therapy as a candidate desease-modifying strategy in Parkinson’s disease and multiple system atrophy.J Clin Neurol,2009,5:1-10.

[4] Yang CC，Shih YH，Ko MH, et al.Transplantation of human umbilical mesenchymal stem cells from Wharton’s jelly after complete transection of the rat spinal cord .PLoS One．2008:3(10):e3336．

[5] Cho PS,Messina DJ,Hirsh EL,et al.Immunogenicity of umbilical cord tissue derived cells.Blood,2008,111(1):430-438.

[6] Nishida K，Tanaka N，Nakanishi K，et al.Magnetic targeting of bone marrow stromal cells into spinal cord：through cerebrespinal fluid．Neuroreport，2006,17(12):1269-1272．

[7] Satake K，Lou J，Lenke LG．Migration of mesenchymal stem cells through cerebrospinal fluid into injured spinal cord tissue.Spine, 2004,29(18):1971- 1979．

[8] Pal R, Venkataramana NK, Bansal A，et al. Ex vivo-expanded autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in human spinal cord injury/paraplegia: a pilot clinical study. Cytotherapy. 2009;11(7):897-911

[9] Ichim TE,Solano F,Lara F,et al.Feasibility of combination allogeneic stem cell therapy for spinal cord injury:a case report. Int Arch Med. 2010;3:30

[10] Shetty P,Cooper K,Viswanarhan C.Comparison of proliferative and multilineage differentiation potentials of cord matrix,cord blood,and bone marrow mesenchymal stem cells.Asian J Transfus Sci.2010,4(1):14-24 .

[11] Ding DC,Shyu WC,Chiang MF ,et al.Enhancement of neuroplasticity through upregulation of betal-integrin in human umbilical cord-derived stromal cell implanted stroke model.Neurobiol Dis,2007,27(3):339-353.

[12] Koh SH,Kim KS,Choi MR,et al.Implantation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a neuroprotective therapy for ischemic stroke in rats.Brain Res,2008,1229:223-248.

[13] Yoo KH, Jang IK, Lee MW ,et al. Comparison of immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from adult human tissues. Cellular Immunology,2009,259(2):150–156.

[14] Okano H，Ogawa Y，Nakamura M, et al.Transplantation of neural stem cells into the spinal cord after injury．Semin Cells Dev Bio,2003,14(3):191 -198．

  Tag: 脐带血| 脐带| 脐带干细胞| 脂肪干细胞| 胎盘干细胞| 羊胎水| 抗衰老| 

刘静1 韩冬梅1 王志东1 薛梅1 朱玲1 阎洪敏1 郭子宽2 王恒湘1

【摘要】 目的 观察脐带间充质干细胞（UC-MSCs）鞘内注射治疗脊髓损伤（SCI）的临床效果及安全性。方法 对2008年1月至2010年10月收治的22例SCI患者，给予UC-MSCs鞘内注射治疗，细胞数1x106个/kg.次，1 次/周，4次为1个疗程，其中4例接受两疗程，1例接受3疗程，余均接受1 个疗程。采用美国脊髓损伤协会制定的脊髓损伤神经功能评分标准(ASIA标准)对患者治疗前后神经功能进行评定，采用国际神经修复学会脊髓损伤功能评价量表（IANR-SCIRFS）对患者治疗前后日常生活活动能力进行评定。结果 22例患者中13例有效，9例无效。不完全性SCI患者有效率达81.25%，完全性SCI的6例患者均无效。有5例有效的患者接受了2～3个疗程治疗，疗效均有进一步的提高。有效患者多表现为运动和/或感觉功能改善，大小便控制能力增强。22例患者治疗后1个月与治疗前两组间比较痛觉、触觉、运动、日常生活活动能力评分有明显升高(P < 0.01)。治疗后常见的不良反应有头痛（1例），腰痛（1例），均在1～3天内消失。随访3个月～3年，无治疗相关不良事件发生。结论 UC-MSCs鞘内注射治疗是安全的，可以改善大部分不完全性SCI患者的神经功能，提高这些患者的生活质量。

【关键词】 脐带间充质干细胞；脊髓损伤

Clinical analysis of umbilical cord mesenchymal stem cells treating spinal cord injury

LIU Jing1,HAN Dongmei1,WANG Zhidong1,XUE Mei1,ZHU Ling1,YAN Hongmin1,GUO Zikuan2,WANG Hengxiang1

1 100142 Department of Hematology, General Hospital of the Air Force,Beijing

2 100850 Department of Experimental Hematology,Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing

【Abstract】 OBJECTIVE To observe the clinical effect and safety of

基金项目：首都发展基金项目（2007-2033）；国家高新技术研究发展计划（863项目）（2007AA 022454）；国家重大新药创制基金（20092x09503-019）；军队临床高新技术重大项目（2010gxjs049）

作者单位：100036 北京，空军总医院血液科（刘静 韩冬梅 王志东 薛梅 朱玲 阎洪敏 王恒湘）；100850北京，北京放射与辐射医学研究所（郭子宽）

通信作者：王恒湘，Email：wanghengxiang123@yahoo.com.cn

umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) in treating spinal cord injury (SCI) by intrathecal injection. METHODS From January 2008 to October 2010,22 admitted patients with SCI were given UC-MSCs by intrathecal injection,at a dose of 1 x 106 cells/kg body weight once a week,4 times as a course.Besides 4 cases received 2 couses and 1 cases received 3 couses,others received 1 couse.American Spinal Injury Association (ASIA) scoring system and International Association of Neurorestoratology SCI Functional Rating Scale (IANR-SCIFRS) were used to evaluate SCI patient’s neural function and ability of daily living. RESULTS Among 22 cases,13 cases were effecttive,9 cases had no response. The effective rate of incomplete SCI cases was 81.25%,all of 6 cases with complete SCI had no response. There were five effective patients received 2～3 couses therapy,effects were further enhanced. In most effective patients,motor and/or sensory functions improved,bowel and bladder control improved. One month after therapy compared with before therapy, 22 patient’s algaesthesis,tactile sensation,motion,activity of daily living scale were obviously increased (P < 0.01). After therapy,common adverse effects were headache (1 case),low back pain (1 cases),all disappeared within 1～3 days.Follow up 3 months to 3 years,no treatment-related adverse events happened.CONCLUSION UC-MSCs therapy by intrathecal injection is safe,and can ameliorate most of incomplete SCI patient’s neurological function,as well as improve these patient’s quality of life.

【Key Words】 umbilical cord mesenchymal stem cells,spinal cord injury

SCI是一种较为常见的神经系统严重创伤, 常导致瘫痪及大小便失禁,手术、药物、康复理疗治疗效果欠佳。UC-MSCs来源于脐带，易于获取，体外能够大量扩增，低免疫原性，具有横向分化的潜能，在适当的条件下可向外胚层的神经细胞分化。临床上，采用人UC-MSCs治疗SCI国内尚无报道，我们采用UC-MSCs鞘内注射治疗22例SCI患者，取得一定疗效，现报告如下。

资料与方法

一、 研究对象

对象选择自我科2008年1月至2010年10月收治的22例SCI患者，男17例，女5例，年龄19～51岁，平均年龄33岁；损伤部位：颈髓4例，颈髓+胸髓2例，胸髓7例，胸髓+腰髓2例，腰髓7例；损伤时间2～204月，平均56个月。损伤原因：车祸8例，高空坠落7例，砸伤及跳水损伤各2例，摔伤、脊髓炎后遗症、脊髓栓系综合征各1例。对患者的治疗及风险如实告知，患者对治疗均签署知情同意书，治疗方案经医院医学伦理委员会批准。所有患者均具有干细胞治疗适应症：无发热、感染，无凝血功能及心、肺、肝、肾等重要脏器功能障碍。术前对患者进行总体评估：体格检查，ECG、脊髓损伤部位MRI检查，血、尿、便常规、肝肾功、凝血象、手术感染8项。

二、方法

1. UC-MSCs制备：按参考文献提供的方法[1]，稍加改良后进行UC-MSCs制备。简言之，经知情同意及感染源检定后收集脐带，去除外膜和动静脉，将脐带剪成0.5cm3大小的组织块，加入等体积0.2%I型胶原酶，37℃消化过夜。次日，加入两倍体积的0.05%的胰蛋白酶，37℃消化1小时。2000rpm离心10分钟收集细胞，计活细胞数。将细胞悬浮于人MSC无血清培养基（杭州百威）中，按106细胞/cm2底面积接种于塑料培养瓶中。1周后出现由数十个形态类似于成纤维细胞组成的集落。加入0.05%胰蛋白酶消化，并按6000细胞/cm2底面积进行传代培养。利用流式细胞术测定细胞表型，常规感染源检定后，收集细胞用于治疗。或收获细胞放于-80℃冰箱冻存备用,用前，在37℃环境下快速复苏,24～48小时培养，收获贴壁生长的细胞供临床应用。

2. UC-MSCs注射：入院第3或第4天开始给患者行腰穿，鞘内注射UC-MSCs，1次/周，4次为1个疗程。按诊疗常规进行腰穿，将UC-MSCs 10 mL(1x106/kg.次)+地塞米松5mg在10 min内缓慢注入蛛网膜下腔，拔针，敷以无菌辅料，嘱患者去枕平卧6 小时。

3．辅助治疗：系统康复锻炼。

4．评估标准[2]：（1）采用美国脊髓损伤协会制定的脊髓损伤神经功能评分标准(ASIA标准)对患者治疗前后神经功能进行评定：检查颈2到骶4～5神经支配的身体两侧各自28个皮节区痛觉和触觉，按消失、减退、正常分别给予O、l、2分，痛觉、触觉总分均为112分；检查颈5到骶1神经支配的身体两侧各自10个肌节中的关键肌，按肌力0～5级分别给予0～5分，总分为100分；（2）采用国际神经修复学会脊髓损伤功能评价量表（IANR-SCIRFS）对患者治疗前后日常生活活动能力进行评定，包括上、下肢、躯干、全身运动功能、括约肌功能、肌张力、泌汗、皮肤营养、疼痛，最高分48分为正常。分值越低表示神经功能缺损越严重，日常生活活动能力越差；（3）损伤完全性评定：完全性损伤：损伤平面以下包括骶4～5既无感觉也无运动功能；不完全性损伤：损伤平面以下包括骶4～5有感觉（或）运动功能。

5．不良反应及并发症观察：观察治疗中及治疗后有无发热、腰痛、头痛、头晕等不良反应。

6．随访 对患者治疗后3个月、半年以及之后每半年随访1次，观察病情变化。

7． 统计学分析：采用SPSS 11.5软件包进行统计处理，计量资料以 SD表示，行数据配对t 检验、成组资料t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

结果

一、临床疗效：

1．22例患者中13例有效，总有效率为59.1%，9例无效。有5例有效的患者接受了2个或3个疗程治疗，疗效均有进一步的提高。有效患者多表现为运动和/或感觉功能改善，大小便控制能力增强。

2. 22例患者ASIA评分及IANR-SCIRFS评分显示：治疗后1个月与治疗前两组间比较痛觉、触觉、运动、日常生活活动能力评分有明显升高(P < 0.01)，见表1。

3．16例不完全性SCI患者中13例有效，有效率达81.25%，3例无效，治疗结束后1个月与治疗前两组间比较，痛觉、触觉、运动及日常生活活动能力评分有明显提高(P < 0.01)，6例完全性SCI患者均治疗无效，见表2。

4.SCI部位存在软化灶的6例患者中5例治疗无效，无效的患者2例为不完全性SCI，3例为完全性SCI。

5.有效的13例患者损伤的时间2～204个月，平均59个月，无效的9例患者损伤时间4～136月，平均51个月，两组患者损伤时间无显著差异（P > 0.05）。

6.不良反应及并发症：UC-MSCs治疗中及治疗后，患者的生命体征均平稳。1例治疗后感头痛，1例治疗后感腰痛，未经特殊处理，1～3天后症状消失。无发热及其他不良反应。

7.随访 13例有效患者中9例治疗1月后疗效不再增加，3例治疗3月后疗效不再增加，1例治疗1年后疗效不再增加；9例无效患者病情无变化；所有患者无UC-MSCs治疗相关的不良事件发生。

讨论

SCI是致残率最高的疾病之一，最常发生于青壮年，导致病人损伤平面以下感觉、运动功能丧失和/或大小便失禁,不仅给病人造成极大的痛苦,同时也给家庭和社会带来沉重的负担。脊髓损伤可分为外伤性和非外伤性两种，前者占90%以上。本组患者除2例疾病引起外，20例为外伤所致，其中车祸、高空坠落为主要外伤原因，占75%。目前SCI修复面临的主要问题是：原发和继发性神经元死亡，大量的轴突变性和弥漫性脱髓鞘；损伤后胶质瘢痕形成阻碍了轴突生长；局部炎症反应和神经营养因子、神经生长因子的缺乏，以及SCI后损伤区微环境中大量的抑制因子的产生(如硫酸软骨素蛋白多糖、髓磷脂相关糖蛋白等)，极大地阻碍了损伤神经的修复。手术、药物、物理康复等治疗都不能有效地解决这一世界级难题。间充质干细胞（MSCs）具有来源广泛、取材容易、具有强大的增殖能力、在体外长期培养过程中始终保持其多向分化潜能，在适宜的条件下能分化为神经元及神经胶质细胞，还可分泌多种神经营养因子（NTFs）如神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）[3,4]，且在异基因移植中不存在免疫排斥反应[5]，也不涉及医学伦理问题，为中枢神经系统损伤提供了新的治疗途径。

动物实验已证明MSCs具有促进神经修复的作用。将大鼠MSCs注入脊髓损伤大鼠蛛网膜下腔，损伤部位的MSCs明显高于未受损部位，一些MSCs可分化为神经元和神经胶质细胞，促进脊髓损伤的修复，且在体内无免疫排斥[6,7]。Yang等[4]将人UC-MSCs移植到完全性横惯性SCI大鼠的损伤部位，大鼠的运动功能得到显著改善，病变周围皮质脊髓束再生轴突和神经微丝的数目显著增加。目前MSCs治疗SCI所取得的研究成果多局限于动物模型，在临床上的应用仍处于起步阶段。Pal等[8]将体外扩增的自体骨髓MSCs（1x106个/kg体重）鞘内注射给30例SCI患者，随访1～3年无不良事件发生。Ichim等[9]将异基因体外扩增的脐带血CD34+细胞及UC-MSCs分别于损伤后5月、8月、14个月鞘内注射给1例腰髓损伤患者，该患者肌力、排便及性功能改善，神经疼痛减轻，无副作用发生。我们将体外扩增的UC-MSCs鞘内注射给22例SCI患者，总有效率为59.1%，有效患者增加疗程数疗效有一定提高；对不完全性SCI患者有效率达81.25%；但对完全性SCI患者无效；损伤部位如果存在软化灶的患者总体疗效欠佳，6例患者中仅1例有效。治疗过程安全，随访3月～3年无不良事件发生。

MSCs可来源于骨髓、脐带以及脐血。骨髓MSCs含量低，104～105个骨髓单个核细胞含有1个MSC，患者要经历采髓过程，还需要等待3周左右体外培养扩增；人脐血含有MSCs，但传代培养困难，不易大量获得；人脐带华尔通胶含有丰富的MSCs，在体外能够大量扩增，还可将其冻存，应用前复苏，短时间内即可收获足够量的细胞。Shetty等[10]比较骨髓、脐带、脐血获得的MSCs，这三种来源的MSCs具有同样的MSCs表面分子表达：CD73+、CD105+、SSEA4+、CD29+、CD44+、HLA ABC+，而脐带MSCs（UC-MSCs）与脐血MSCs（UCB-MSCs）不表达与移植排斥相关的HLA DR，在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制，并抑制T细胞增殖，异体移植该细胞可产生免疫耐受性[5]，表明其为一类免疫缺陷细胞，异基因移植不会发生免疫排斥反应。基于上述，我们选择人UC-MSCs治疗SCI。

鞘内注射的MSCs进入脊髓组织时要通过脑脊液-脑屏障， 其通过的机制可能包括：(1)脊髓损伤各种炎性因子和血管活性物质释放，使脑脊液-脑屏障的通透性增加；(2)脊髓损伤部位对MSCs具有一定的趋化作用。关于UC-MSCs治疗脊髓损伤的作用机制尚不完全清楚，可能有：(1)UC-MSCs向病变部位组织渗透融合，一些移植的MSCs在新的环境下表达神经细胞表型，替代损伤细胞，重建神经通路，达到恢复神经功能的目的；(2) UC-MSCs分泌的各种NTFs，如NGF、BDNF、GDNF等，支持神经细胞生存，诱导内源性神经细胞再生，促进神经纤维在损伤部位再生 [11,12];(3)通过细胞间的接触、可溶性细胞因子分泌，抑制T淋巴细胞活性，调节炎性反应[13]。

MSCs移植治疗SCI的适宜时间，目前研究尚未统一。从病理机制上讲，SCI后急性期由于血-脊髓屏障破坏，损伤区有严重的免疫炎性反应，多种炎性因子具有神经毒性及胶质细胞的诱发作用，使局部的微环境不适合MSCs的存活和分化。而SCI时间过长，损伤区胶质瘢痕的形成不利于轴突的生长。Okano等[14]提出SCI后干细胞移植的最佳时间应选择在损伤后l～2周，在此期间进行移植，既可解除急性期各种炎性因子对移植细胞的损害，又可避免慢性期胶质瘢痕对轴突再生的干扰。本组患者均在慢性期行MSCs治疗，有效患者与无效患者在损伤时间上无明显差异。

本研究表明，UC-MSCs蛛网膜下腔注射治疗SCI是安全的，可使大部分不完全性SCI患者神经功能在一定程度上得到恢复，但对完全性SCI患者无效，存在软化灶的患者多数疗效较差。UC-MSCs治疗SCI的作用机制有待进一步研究，移植时机的选择、取得显著疗效所需的MSCs的数量、疗程数，以及最佳的治疗途径，需要大宗病例长期的随机对照研究。

参考文献

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